Принцип работы и особенности
Принцип работы основан на явлении флуоресценции (частный случай люминесценции), физическая природа которой состоит в излучательных переходах электронов из возбуждённого состояния в основное. Вещества, молекулы которых обладают способностью к флуоресценции, называются флуорохромами или флуорофорами.
Согласно правилу Стокса, спектр испускания света флуоресценции всегда сдвинут относительно спектра поглощения в более длинноволновую сторону. Это объясняется потерей некоторой части поглощённой энергии на безызлучательные релаксационные процессы (тепловое движение молекул). Квантовый выход флуоресценции, т.е. отношение количества излучаемых фотонов к поглощённым, всегда меньше единицы, таким образом, эмиссия всегда будет слабее возбуждающего излучения.
Источником возбуждения света во флуоресцентном микроскопе часто служит газоразрядная (ртутная) лампа или светодиоды.
Самая распространённая оптическая схема современных флуоресцентных микроскопов – схема с эпифлуоресценцией, при которой возбуждение и наблюдение происходит через один и тот же объектив в отражённом свете. Также используются специальные светофильтры – возбуждающий, который вырезает из всего спектра источника полосу для возбуждения конкретного флуорохрома и запирающий или эмиссионный, который из всей флуоресценции вырезает свет, излучаемый флуорохромом. Оба светофильтра для удобства работы часто объединены в единый светоделительный модуль (куб), имеющий также дихроичное зеркало, которое отражает и пропускает свет с разными длинами волн. Применение дихроичного зеркала обусловлено тем, что источник света развернут на 90° по отношению к главной оптической оси микроскопа. Флуоресцентный микроскоп может иметь одновременно несколько наборов фильтров (кубов) для раздельной регистрации сигналов от различных флуорохромов.
Поскольку флуоресценция относится к светодефицитным методам микроскопии, то в качестве детектора часто используются цифровые камеры с высокой чувствительностью без RGB-светофильтров, т.е. монохромные. Тем не менее, итоговые изображения могут быть цветными за счёт присвоения цвета разным каналам, отвечающим за разные флуорохромы и оптические диапазоны светофильтров. Такой подход называется мультиканальной флуоресценцией.
Согласно правилу Стокса, спектр испускания света флуоресценции всегда сдвинут относительно спектра поглощения в более длинноволновую сторону. Это объясняется потерей некоторой части поглощённой энергии на безызлучательные релаксационные процессы (тепловое движение молекул). Квантовый выход флуоресценции, т.е. отношение количества излучаемых фотонов к поглощённым, всегда меньше единицы, таким образом, эмиссия всегда будет слабее возбуждающего излучения.
Источником возбуждения света во флуоресцентном микроскопе часто служит газоразрядная (ртутная) лампа или светодиоды.
Самая распространённая оптическая схема современных флуоресцентных микроскопов – схема с эпифлуоресценцией, при которой возбуждение и наблюдение происходит через один и тот же объектив в отражённом свете. Также используются специальные светофильтры – возбуждающий, который вырезает из всего спектра источника полосу для возбуждения конкретного флуорохрома и запирающий или эмиссионный, который из всей флуоресценции вырезает свет, излучаемый флуорохромом. Оба светофильтра для удобства работы часто объединены в единый светоделительный модуль (куб), имеющий также дихроичное зеркало, которое отражает и пропускает свет с разными длинами волн. Применение дихроичного зеркала обусловлено тем, что источник света развернут на 90° по отношению к главной оптической оси микроскопа. Флуоресцентный микроскоп может иметь одновременно несколько наборов фильтров (кубов) для раздельной регистрации сигналов от различных флуорохромов.
Поскольку флуоресценция относится к светодефицитным методам микроскопии, то в качестве детектора часто используются цифровые камеры с высокой чувствительностью без RGB-светофильтров, т.е. монохромные. Тем не менее, итоговые изображения могут быть цветными за счёт присвоения цвета разным каналам, отвечающим за разные флуорохромы и оптические диапазоны светофильтров. Такой подход называется мультиканальной флуоресценцией.
Основные области применения
Метод подходит для органических и неорганических веществ, когда требуется высокий контраст и точная идентификация различных структур изучаемого объекта. За счёт чувствительности и контроля длины волны удаётся фиксировать слабые сигналы, которые не видны в стандартном оптическом микроскопе.
В медицине и биологических науках флуоресцентный микроскоп используют для исследования клеток и тканей. Метки и красители помогают отслеживать распределение биомолекул, выявлять изменения в структуре и наблюдать процессы в динамике. Это делает данный метод незаменимым для микроскопии клеток и работы с живыми системами и биологическими образцами.
В материаловедении флуоресцентный микроскоп используют для исследования покрытий, композитов и выявления микро-дефектов. Это даёт возможность находить неоднородности, следы примесей и зоны напряжений.
Для исследований, требующих максимального оптического и спектрального разрешения, используют модификацию этого метода - конфокальную микроскопию. Это даёт трёхмерную визуализацию и точный анализ образцов.
В медицине и биологических науках флуоресцентный микроскоп используют для исследования клеток и тканей. Метки и красители помогают отслеживать распределение биомолекул, выявлять изменения в структуре и наблюдать процессы в динамике. Это делает данный метод незаменимым для микроскопии клеток и работы с живыми системами и биологическими образцами.
В материаловедении флуоресцентный микроскоп используют для исследования покрытий, композитов и выявления микро-дефектов. Это даёт возможность находить неоднородности, следы примесей и зоны напряжений.
Для исследований, требующих максимального оптического и спектрального разрешения, используют модификацию этого метода - конфокальную микроскопию. Это даёт трёхмерную визуализацию и точный анализ образцов.
Часто задаваемые вопросы
Суть флуоресцентной микроскопии в селективности. Вы видите только те структуры, которые светятся. Флуорофоры реагируют на возбуждение света и дают испускание света в нужном диапазоне, а фильтры отсекают лишнее. В результате наблюдение идёт на тёмном фоне с высоким контрастом, что ускоряет поиск нужных деталей и упрощает интерпретацию данных.
Купить флуоресцентный микроскоп стоит лабораториям, исследовательским центрам и производственным подразделениям, которым важно точно выявлять молекулы, клетки или дефекты материалов и получать воспроизводимые результаты при анализе сложных образцов.
Купить флуоресцентный микроскоп стоит лабораториям, исследовательским центрам и производственным подразделениям, которым важно точно выявлять молекулы, клетки или дефекты материалов и получать воспроизводимые результаты при анализе сложных образцов.
Флуоресцентный микроскоп построен вокруг оптической системы, которая разделяет возбуждение и наблюдение сигнала. Источник света создаёт интенсивный поток излучения нужной длины волны. Этот свет проходит через оптические фильтры и направляется к образцу. Фильтры отсекают лишний спектр и оставляют только диапазон, подходящий для возбуждения флуорофоров.
Ключевым элементом выступает объектив, который одновременно фокусирует подсветку на образце и собирает свет эмиссии. Далее сигнал проходит через фильтры эмиссии, которые пропускают только необходимые длины волн. После этого увеличенное изображение поступает на детектор или цифровую камеру.
Структура оптических компонентов рассчитана на работу со слабым сигналом. Благодаря этому получается стабильная визуализация даже при минимальном уровне флуоресценции. Именно такая схема делает флуоресцентную микроскопию точным и воспроизводимым методом анализа образцов.
Ключевым элементом выступает объектив, который одновременно фокусирует подсветку на образце и собирает свет эмиссии. Далее сигнал проходит через фильтры эмиссии, которые пропускают только необходимые длины волн. После этого увеличенное изображение поступает на детектор или цифровую камеру.
Структура оптических компонентов рассчитана на работу со слабым сигналом. Благодаря этому получается стабильная визуализация даже при минимальном уровне флуоресценции. Именно такая схема делает флуоресцентную микроскопию точным и воспроизводимым методом анализа образцов.