Биотехнологическое производство ежедневно имеет дело с культурами клеток и требует поддержания определенных качественных и количественных параметров на протяжении всего процесса. К таким параметрам, прежде всего, относятся количество (концентрация) клеток и их жизнеспособность. Почему так важно знать эти параметры? Рассказывает Татьяна Канышкова, кандидат химических наук и ведущий эксперт по биовизуализации ООО «Лакопа».

Исследования ДНК, РНК и белков требуют качественной визуализации и количественной оценки этих биополимеров. Наиболее популярным решением этих задач одновременно является электрофорез в агарозном/полиакриламидном геле с последующим документированием гелей или, в случае белков, мембран, на которые перенесена реплика геля.

Существует множество способов окраски образцов, как прямых (окраска непосредственно в геле), так и опосредованных (окраска мембран с перенесенными белками). Последние, как правило, используют в том случае, когда необходимо специфически окрасить одну или несколько мишеней в образце (-ах).

К выбору документирующей системы следует относиться особенно внимательно. Следует учитывать, что этот прибор предназначен для частого, в большинстве случаев, каждодневного использования многими пользователями. Поэтому важна его эргономика — насколько быстро и удобно можно провести манипуляции и получить результат, надежность — как долго прослужит прибор, универсальность и соответствие задачам лаборатории.

Если мы говорим о технических параметрах системы, следует прежде всего упомянуть чувствительность. На рис. 1 схематически представлен путь формирования итогового изображения от захвата сигнала образца с помощью объектива системы гель-документирования до итогового снимка. Именно снимок будет проанализирован и обсчитан, поэтому его качество является определяющим.

Ключевыми компонентами (рис. 1) являются объектив (линза) и камера прибора. Объектив обеспечивает разрешение снимка, т. е. количество пикселей изображения, которые могут быть определены и обсчитаны как индивидуальные точки исходного объекта, а также качество этих сигналов (отсутствие искажений, дисторсий и проч.) — того, что ухудшает разрешение изображения в силу волновой природы света.

На рис. 2 приведен пример сравнения двух систем с различной степенью компенсации дисторсии по полю зрения. Видно, что на изображении справа фокус различен для разных областей образца (обратите внимание на выделенные желтым фрагменты), из-за этого может искажаться не только качественная, но и количественная информация. Слева для сравнения показан пример скорректированной по полю дисторсии объектива (производитель 2).

Камера системы переводит визуальный сигнал в цифровой и формирует итоговое изображение на основе последнего. Какие же параметры камеры важны? Давайте рассмотрим физику процесса.

На рис. 3 схематично представлен процесс преобразования фотонов (световая информация от объекта исследования) в электроны (цифровая информация). Эффективность процесса определяет чувствительность цифровой камеры и характеризуется величиной QE (квантовая эффективность); чем она выше, тем более чувствительна система, тем больше информации об объекте мы может собрать. Величина QE зависит от длины волны фотонов — типичная форма приведена на рис. 4.

Заметим, что максимум эффективности наблюдается в видимой области спектра (400−750 нм), это характерно для большинства современных цифровых камер. Если Вы планируете работу, например, с красителями в области дальнего красного (Cy 5, Cy 5.5 и проч.), убедитесь в том, что камера системы поддерживает регистрацию сигнала в области этих сигналов на должном уровне — иначе время накопления сигнала, и, соответственно, соотношение сигнал/шум итогового изображения могут оказаться неудовлетворительными.

Говоря о характеристиках камеры следует обсудить влияние на качество итогового изображения таких параметров, как разрешение камеры — количество пикселей сенсора и их организацию. На рис. 4 схематично представлены два сенсора камер: сенсоры имеют одинаковый физический размер, но разное количество пикселей.

Тот сенсор, у которого количество пикселей больше (справа), конечно же, обеспечивает лучшее разрешение. А тот, у которого количество пикселей меньше имеет пиксели большего размера и, соответственно, более чувствителен, так как каждый пиксель захватывает большее количество сигнала. Что важнее? Важен баланс.

Для современных гель-документирующих систем производители наиболее часто останавливают свой выбор на 6 Мп сенсорах камер, поскольку этого разрешения достаточно для адекватной передачи оптического сигнала, захватываемого объективом системы. Большее количество пикселей камеры может быть использовано для расширения диапазона чувствительности за счет биннинга — объединение пикселей матрицы с целью их укрупнения (рис. 6).

Очевидно, что биннинг приводит к падению общего разрешения системы, но в случае слабых сигналов его использование может быть оправдано.

Влияние темнового тока можно и нужно компенсировать. Его минимизация достигается охлаждением сенсора камеры (рис. 8). Из графика зависимости компенсации темнового тока от температуры охлаждения сенсора видно, что компенсаторный эффект падает с уменьшением температуры и при достижении -25оС — -30оС выходит на плато. Дальнейшее охлаждение сенсора не имеет смысла и не несет дополнительных бенефитов.

При выборе прибора нужно четко понимать для каких задач вы будете его использовать. Современные гель-документирующие системы могут сочетать различные типы осветителей:

Трансиллюминаторы — детекция ДНК/РНК и белков в геле. Образец помещается на поверхность трансиллюминатора и освещается снизу, свет проходит сквозь образец. Для детекции нуклеиновых кислот используют UV или Blue-LED осветители, для детекции окраски белков в гелях используют трансиллюминатор белого света.

Эпи-осветители — осветители белого света и флуоресцентные модули, располагающиеся над образцом и освещающие его сверху. Осветитель белого света используется обычно для правильного размещения образца до фотодокументирования, а также для захвата нативного изображения непрозрачных образцов, обычно, маркеров на мембране при детекции хемилюминесценции или флуоресценции.

В случае если в вашей лаборатории работают только с агарозными и ПАА гелями можно остановиться на стандартной системе, в которой источниками освещения являются трансиллюминаторы. Если в круг задач входит детекция хемилюминесценция (Вестерн-блоттинг и т.д.), то система должна быть оснащена возможностью ее детекции. Хемилюминесценция не требует освещения, единственное требование – возможности объектива системы и программного обеспечения для захвата и анализа сигнала этого типа.

Если в круг задач лаборатории входит окраска мембран либо других образцов флуоресцентными красителями – обычно речь идет об иммунофлуоресцентной детекции мишеней, система должна быть оснащена подходящими флуоресцентными модулями – осветителями и светофильтрами требуемого диапазона длин волн.

• Осветители (обычно LED) устанавливаются внутри корпуса системы и позиционируются на заводе.
• Светофильтры, отсекающие нецелевые световые сингалы размещают непосредственно перед объективом системы.

В силу особенностей расположения компонентов для флуоресценции (рис. 9) настоятельно рекомендуется конфигурировать прибор до приобретения, поскольку юстировка освещения чрезвычайно важна и замена осветителей и светофильтров постфактум нежелательна.

Конструкции современных систем представляют собой закрытый корпус — «тёмную комнату», в которую помещается образец. Доступ к образцу может осуществляться двумя способами — открытием дверцы корпуса или выдвигаемого поддона для образцов (рис. 10). Сложно говорить о преимуществах в использовании систем того или иного типа конструкции — как правило, пользователь сам решает, что ему подходит больше в силу организации рабочего пространства в лаборатории и/или личных предпочтений.

Современные конструкции систем с выдвижным поддоном часто комплектуются встроенным экраном или управляющим ПК. Последнее, безусловно, предпочтительнее, поскольку обеспечивают систему полноценным компьютером с характеристиками, позволяющими не только получать, но и хранить и обрабатывать результаты, интегрировать прибор в общелабораторную сеть и другим полезным функционалом. Однако, важным является то, насколько этот компонент интегрирован
в систему — ведь если управляющий компьютер или экран является частью системы, то его замена в случае поломки может представлять проблему. Отличным решением считается съемный управляющий ПК (рис. 11).

Системы для гель-документирования могут быть оснащены дополнительным полезным функционалом. К числу полезных функций можно отнести многоуровневую организацию платформы для образцов. Эта функция практически бесполезна для детекции нуклеиновых кислот и белковых гелей, а для хемилюминесценции может играть важную роль. Расположение образца на ближних к объективу уровнях (рис. 12) дает значительный выигрыш в интенсивности сигнала, и в случае низких значений экспрессии таргетных мишеней это может значительно облегчить детекцию.

В заключении следует отметить, что ведущие производители гель-документирующих систем всегда предлагают полную линейку продуктов для различных задач пользователя. Важным дополнением может быть наличие в портфеле всех необходимых сопутствующих компонентов — камер для электрофореза и блоттинга, источников питания и т. д. (рис. 13).