Подсчёт клеток:
правила и регуляция

Биотехнологическое производство ежедневно имеет дело с культурами клеток и требует поддержания определенных качественных и количественных параметров на протяжении всего процесса. К таким параметрам, прежде всего, относятся количество (концентрация) клеток и их жизнеспособность. Почему так важно знать эти параметры? Рассказывает Татьяна Канышкова, кандидат химических наук и ведущий эксперт по биовизуализации ООО «Лакопа».

Введенный в 2023 году и вступивший в силу с 1 марта 2024 года ГОСТ Р ИСО 20 391 определяет, что подсчет клеток «…является фундаментальным измерением, которое напрямую влияет на многие аспекты биотехнологии, от биопроизводства до передовой терапии», поскольку «…количество клеток имеет решающее значение при оценке потенциала и эффективности клеточной терапии», а «…концентрация клеток в биореакторе может служить критерием обеспечения качества в клеточных производственных процессах».

Методы подсчета имеют двойную систему распределения. Прежде всего, методы подсчета подразделяются на прямые — те, в которых клетки подсчитываются непосредственно, на основании сигналов, поступаемых от каждой клетки, и на косвенные, в которых количество клеток может быть рассчитано на основании математической модели соотнесения измеряемых сигнала/-ов, полученных от культуры в целом.

Помимо этого, методы подсчета также делятся на общий (оценивается общее количество клеток в образце) и дифференцированный (измеряются подмножества клеток, отличающихся от остальных как минимум одним характеристическим признаком).

При выборе метода подсчета необходимо обращать внимание на следующие моменты:

• обоснование используемого метода;
• надлежащие процедуры отбора проб. Должны быть исследованы: определенная часть партии / объем / кол-во проб / разведений и т.д.;
• надлежащие процедуры приготовления проб учет условий окружающей среды;
• учет влияния оборудования и реактивов на проводимую процедуру подсчета;
• использование надлежащего оборудования для подсчета: калибровка и квалификация в соответствии с утвержденными процедурам (iq, oq, pq).

Один из основных методов — метод автоматического анализа изображений. Он основан на программной обработке высококачественного микроскопического изображения образца с помощью алгоритмов автоматического распознавания и подсчета клеток.

При использовании метода автоматического анализа изображений важно соблюдать следующие рекомендации:

• проводить измерения в надлежащем диапазоне, соответствующем размерам исследуемых клеток (захват всех клеток в анализируемом поле, сепарация дебриса, конгломератов и агрегатов, подсчет требуемых субпопуляций клеток);
• обеспечивать правильную фокусировку на исследуемом образце;
• использовать надлежащий алгоритм подсчета и анализа клеток.

При работе с клетками основная сложность заключается в отсутствии «идеального клеточного образца», который мог бы использоваться в качестве эталона при валидации методов.

В качестве стандартных образцов для верификации, квалификации и валидации используются аттестованные стандартные образцы при их наличии, либо собственные стандартные образцы. Допускается использование стандартных образцов неклеточной природы — частицы определенного размера калибровочные микросферы, флуорофоры с заданным значением интенсивности сигнала.

Отчет должен содержать достаточное количество параметров с тем, чтобы можно было провести независимую оценку результатов:

• ID пробы: тип клеток, происхождение, номер партии;
• используемые реактивы: наименование, источник, номер партии;
• методы и условия подготовки проб;
• информация об используемом оборудовании;
• информация о квалификации, валидации и верификации;
• результаты исследований и используемого метода анализа данных;
• примечания.

План эксперимента включает в себя ряд шагов, необходимых для получения качественных данных:

1. Приготовление серии разведений образца клеток.
2. Визуализация — получение изображений в форматах jpeg, tiff, а также получение числовых характеристик этих изображений в формате xslx.
3. Определение основных характеристических параметров:

• R2 (коэффициент детерминации) — линейность зависимости разведения от концентрации;
• CV (прецизионность) — погрешность измерения;
• PI (индекс пропорциональности) — определение степени соответствия метода подсчета клеток принципу пропорциональности, исходящее из постулата, что количество клеток пропорционально уменьшается с увеличением степени разбавления.

Современные счётчики клеток должны сочетать в себе функционал цифрового микроскопа, цитометра и мощного аналитического аппарата. Именно такими свойствами обладают приборы Countstar от ведущего производителя клеточных анализаторов для биофармацевтического производства.

Приборы Countstar удовлетворяют требованиям чистых помещений. Исследования, проводимые по заказу производителя, показали, что работа приборов Countstar Rigel/Altair соответствует стандартам IS0 4.8 (GMP class A) и не приводит к генерации частиц ≥5,0 мкм.

Приборы Countstar оснащены технологией «фиксированного фокуса», которая позволяет получить качественное и достоверное изображение за счет правильной фокусировки на образце. В приборах Countstar фокус системы чётко выверен и зафиксирован на производстве, что исключает ошибки распознавания клеток алгоритмами ПО. Если же возникает необходимость проверки или настройки системы, пользователь может провести процедуру на рабочем месте с использованием специальных калибровочных реагентов.

Производитель Countstar предлагает документацию IQ/OQ, дизайн документации PQ, стандартные калибровочные микросфреры, флуорофоры и сопутствующие реагенты.

Countstar Altair — это светлопольный анализатор клеток для чистых помещений. Его основные качества — это точность и высокая воспроизводимость измерений. Основные области применения — контроль состояния культуры при разработке технологий, а также контроль качества в биофармацевтическом производстве антител и вакцин и производстве биомедицинских клеточных продуктов.

Countstar Rigel — это компактная и автоматизированная система визуализации. Универсальное решение для анализа жизнеспособности клеток, клеточного апоптоза, клеточного
цикла, T/NK клеточно-опосредованной цитотоксичности и анализа. Большинство биофармацевтических компаний-производителей используют Countstar Rigel для детектции иммунофлуоресцентных меток и количественного анализа.

Программное обеспечение De Novo FCS Express обеспечивает возможность анализа данных изображений как в проточных цитофлуориметрах. ПО преобразует полученные изображения в данные для статического анализа; это позволяет проводить углубленный анализ популяций.

Countstar Mira FL Plus — это валидируемый флуоресцентный счетчик для GMP-производств

Countstar Mira FL PRO — это валидируемый счетчик для микробиологических производств.

Countstar Mira HT — это высокопроизводительный флуоресцентный счетчик для GMP-производств.